La première phase pour isoler(F1)(F2)(F3)(I1) un nouveau gène est d’obtenir une « sonde » spécifique. Généralement, la sonde est constituée de l’ADN d’un gène homologue (on peut, par exemple, créer des gènes semblables à celui qui code pour l’hémoglobine humaine dans d’autres organismes) ou d’ADNc, c'est-à-dire d'une copie de l’ARN produit par le gène en question sous forme d’ADN complémentaire.

Une fois la sonde obtenue, celle-ci peut être marquée par des procédures qui utilisent des nucléotides contenant le radio-isotope du phosphore (P32). Une fois marquée, la sonde peut être utilisée dans la technique d’hybridation, qui permet à des molécules d’ADN semblables de se reconnaître. L’utilisation de la sonde pour l’isolement d’un gène donné est liée à la possibilité de rassembler, dans une série de fragments d’ADN, tout le génome de l’organisme qu’on veut étudier. On parle, dans ce cas, d'une bibliothèque de gènes.

Les fragments d’ADN génomiques sont obtenus au moyen d'enzymes de restriction. Ces mêmes enzymes sont utilisées pour couper l’ADN d’un bactériophage ou d’un plasmide (I2), employés tous les deux comme vecteurs. Les deux types de fragments sont ensuite liés l'un à l'autre (en utilisant l’enzyme ADN-ligase) et incorporés, par exemple, dans une série de vecteurs phages (voir transduction), qu'on a laissés se développer dans des cultures bactériennes sur un substrat dur. Chaque phage recombiné se reproduit en créant une plage de lyse, visible sur le tapis bactérien, qui correspond à une région de Bactéries lysées. Mais, surtout, chaque phage recombiné abrite, à l’intérieur de son génome, un fragment d’ADN exogène correspondant à une région particulière du chromosome de l’organisme en cours d’analyse. Ces collections de phages recombinés constituent une librairie génomique.

À ce point, la seule chose que le chercheur a à faire est d’utiliser la sonde pour chercher dans la librairie génomique le phage recombiné qui abrite le fragment d’ADN contenant le gène qui l'intéresse. Une fois qu’on l’a trouvé, il faut alors isoler le clone phagique recombiné positif à l’hybridation, et le caractériser par une série de techniques standard de biologie moléculaire. Le processus est analogue à la recherche d’un texte dans une encyclopédie informatisée au moyen d'un mot-clé. La sonde (mot-clé) est comparée aux fragments (textes) existant dans la librairie génomique (encyclopédie), jusqu’à ce qu'on obtienne une réponse positive. Comme dans le cas des recherches informatisées, il ne faut pas que le mot-clé et le texte cherché soient parfaitement identiques, il suffit qu’ils soient assez semblables pour qu’on puisse être sûr que l’on a trouvé un texte lié à celui qu’on cherchait. De façon analogue, la séquence cible dans la librairie génomique ne sera pas identique à la sonde, mais le degré d’homologie (une mesure de similarité) sera suffisamment élevé pour qu'on soit certain qu’on a identifié un gène très semblable à celui à partir duquel la sonde a été produite. Dans le cas de l’ADN génomique, le fait que la sonde soit marquée radioactivement permet d’identifier au moyen d’une radiographie le clone contenant le fragment souhaité. Une technique particulièrement efficace récemment mise au point pour isoler de nouveaux gènes est la technique dite cible mutagène.