L’une des applications les plus importantes du génie génétique consiste à cloner (E1) (c'est-à-dire à isoler, puis à amplifier en des millions de copies) des gènes intéressants pour la recherche ou pour des applications pratiques. La première phase de la caractérisation d’un gène est son clonage. Une fois qu’il a été isolé, on pourra le séquencer afin de connaître sa structure nucléotidique primaire.
L’une des méthodes de clonage génique les plus simples utilise un type particulier d’ADN bactérien extra-chromosomique. Plusieurs espèces de Bactéries contiennent des molécules d’ADN circulaire (c'est-à-dire en forme d’anneau), dites plasmides(F1)(F2)(S1), qui viennent s'ajouter au chromosome bactérien normal. De par leur petite taille, les plasmides se prêtent particulièrement à des manipulations avec des enzymes de restriction et peuvent donc être utilisés comme vecteurs pour le clonage de gènes.
Supposons que nous voulions cloner un gène précédemment isolé dans une plante ou un animal. Nous pouvons utiliser la même enzyme de restriction, en mesure, dans ce cas, de créer des extrémités « collantes » à hélice individuelle, pour couper le gène en question et un plasmide bactérien utilisé en tant que vecteur. Nous pourrons, par exemple, choisir un vecteur plasmide contenant deux gènes pour la résistance à deux antibiotiques, l’ampicilline et la tétracycline. Nous choisissons l’enzyme de restriction pour qu’elle coupe l’ADN de l’un des deux gènes du plasmide, par exemple le gène pour la résistance à la tétracycline. L’ADN à cloner et le plasmide s’unissent au moyen des extrémités « collantes » de l’hélice laissée couverte par l’enzyme de restriction. L’enzyme ADN-ligase réunit donc les deux fragments pour obtenir finalement un plasmide complet. À ce point, nous avons créé une molécule d’ADN recombiné, constituée du plasmide original et du nouveau gène, qui se trouvera au milieu du gène du plasmide original qui code pour la résistance à la tétracycline (mais qui, de cette façon, a été interrompu et a perdu sa fonctionnalité).
Comment clone-t-on le plasmide recombiné ?
On peut réinsérer le plasmide dans une Bactérie au moyen de la procédure dite de transformation des Bactéries. La Bactérie ainsi formée est définie à son tour comme un clone ; elle se divisera pour former une colonie de cellules parfaitement identiques. Chaque membre de la colonie aura également une copie du plasmide et, puisqu’une colonie bactérienne peut produire des millions de cellules en quelques heures, nous aurons obtenu des millions de copies du plasmide et, donc, du gène que nous avons inséré. Pour distinguer les Bactéries qui ont effectivement incorporé l’ADN recombiné de celles qui n’ont reçu que le vecteur plasmide refermé sur lui-même, nous pouvons cultiver ces Bactéries dans un milieu ne contenant que l’ampicilline et dans un milieu contenant l’ampicilline et la tétracycline. Les Bactéries recombinées seront en mesure de croître dans le milieu de culture contenant l’ampicilline, mais pas dans celui qui contient la tétracycline, car le gène de la résistance à la tétracycline a été rendu inactif par l’insertion du gène cloné. Il existe une autre méthode pour identifier un gène cloné, appelée blotting.
